13.2  PhÐp thö néi ®éc tè vi khuÈn

 

PhÐp thö néi ®éc tè vi khuÈn dïng ®Ó ph¸t hiÖn hoÆc ®Þnh l­îng néi ®éc tè cña vi khuÈn gram ©m cã trong mÉu thö cÇn kiÓm tra. Ph­¬ng ph¸p sö dông thuèc thö lysat lµ dÞch ph©n gi¶i tÕ bµo d¹ng amip cã trong m¸u mét loµi sam biÓn, Limulus polyphemus hoÆc Tachypleus tridentatus.

HiÖn nay cã 3 ph­¬ng ph¸p ®Ó thùc hiÖn phÐp thö nµy: ph­¬ng ph¸p t¹o gel dùa trªn sù t¹o thµnh gel khi cho thuèc thö vµo dung dÞch cã chøa néi ®éc tè; ph­¬ng ph¸p ®o ®é ®ôc, dùa vµo sù thay ®æi ®é ®ôc cña thuèc thö lysat khi t¹o gel; ph­¬ng ph¸p ®o mµu dùa trªn sù thay ®æi mµu cña phøc hîp mµu - peptid.

Tuú theo ®iÒu kiÖn vµ tÝnh chÊt cña mÉu thö, cã thÓ ¸p dông mét trong c¸c kü thuËt thÝch hîp ®Ó thùc hiÖn phÐp thö. Tuy nhiªn, khi cã nghi ngê hoÆc tranh chÊp, kÕt luËn cuèi cïng sÏ dùa vµo ph­¬ng ph¸p t¹o gel trõ khi cã chØ dÉn kh¸c.

PhÐp thö ®­îc thùc hiÖn trong ®iÒu kiÖn tr¸nh nhiÔm khuÈn.

 

ThiÕt bÞ vµ dông cô:

TÊt c¶ dông cô dïng trong phÐp thö nµy ®Òu ph¶i kh«ng cã chøa néi ®éc tè.

Víi nh÷ng dông cô thuû tinh hoÆc b»ng chÊt liÖu chÞu ®­îc nhiÖt, lo¹i chÊt g©y sèt b»ng c¸ch sÊy ë 250^oC trong Ýt nhÊt 30 phót. NÕu dïng c¸c dông cô lµ chÊt dÎo, nh­ c¸c ®Çu hót cña micropipet hay c¸c khay lç ®Ó lµm ph¶n øng, chØ dïng c¸c lo¹i cã chÊt liÖu kh«ng ¶nh h­ëng tíi phÐp thö vµ kh«ng cã chøa néi ®éc tè.

 

N­íc ®Ó thö néi ®éc tè (n­íc BET hoÆc n­íc LAL): Lµ n­íc tinh khiÕt cho kÕt qu¶ ©m tÝnh trong phÐp thö néi ®éc tè ë ®iÒu kiÖn quy ®Þnh. Cã thÓ dïng n­íc cÊt 3 lÇn hoÆc mét lo¹i n­íc tinh khiÕt thu ®­îc b»ng ph­¬ng ph¸p thÝch hîp kh¸c ®¹t yªu cÇu trªn.

NÕu kh«ng cã chØ dÉn g× kh¸c, dïng n­íc BET hoÆc n­íc LAL lµm dung m«i ®Ó pha tÊt c¶ c¸c dung dÞch dïng trong phÐp thö.

 

Dung dÞch acid hydrocloric 0,1M BET vµ natri hydroxyd 0,1M BET: lµ dung dÞch ®­îc pha tõ acid hydrocloric ®Ëm ®Æc hoÆc natri hydroxid r¾n víi n­íc BET trong mét dông cô kh«ng cã chøa néi ®éc tè.  C¸c dung dÞch nµy ®¹t yªu cÇu nÕu sau khi ®iÒu chØnh ®Õn pH 6,0- 8,0, cho kÕt qu¶ ©m tÝnh trong ®iÒu kiÖn cña phÐp thö.

 

ChuÈn néi ®éc tè vµ dung dÞch chuÈn gèc: chuÈn néi ®éc tè ®­îc sö dông trong phÐp thö nh­ mét chÊt ®èi chiÕu. ChuÈn ®­îc thiÕt lËp vµ ®¸nh gi¸ theo chuÈn néi ®éc tè quèc tÕ. Ho¹t lùc cña chuÈn ®­îc biÓu thÞ theo ®¬n vÞ quèc tÕ qui ®Þnh bëi Tæ chøc Y tÕ thÕ giíi (International Unit = IU) hoÆc ®¬n vÞ néi ®éc tè (Endotoxin Unit – EU). 1 IU t­¬ng ®­¬ng víi 1 EU.

Dung dÞch chuÈn gèc néi ®éc tè ®­îc pha theo quy ®Þnh ®ãng gãi cña tõng nhµ s¶n xuÊt. Trªn nh·n vµ tê h­íng dÉn sö dông kÌm theo ghi râ c¸ch pha, ®iÒu kiÖn b¶o qu¶n vµ sè ®¬n vÞ néi ®éc tè cã trong dung dÞch chuÈn gèc sau khi pha theo h­íng dÉn.

 Pha dung dÞch chuÈn: Pha dung dÞch chuÈn gèc víi n­íc BET/ LAL ®Ó ®­îc d·y chuÈn cã nång ®é thÝch hîp. Tr­íc khi pha, th­êng yªu cÇu l¾c m¹nh dung dÞch chuÈn gèc trong Ýt nhÊt 15 phót, vµ mçi lÇn pha lo·ng, trén c¸c dung dÞch pha lo·ng Ýt nhÊt 30 gi©y. Dïng c¸c dung dÞch chuÈn ®· pha lo·ng cµng sím cµng tèt ®Ó tr¸nh mÊt ho¹t lùc.

 

Dung dÞch thö

ChuÈn bÞ dung dÞch thö b»ng c¸ch hoµ tan hoÆc pha lo·ng mÉu thö víi n­íc BET/ LAL ®Õn ®é pha lo·ng thÝch hîp. Mét sè chÊt hoÆc chÕ phÈm cã thÓ cÇn ph¶i hßa tan hoÆc pha lo·ng trong dung dÞch th©n n­íc kh¸c. pH cña hçn hîp ph¶n øng ph¶i n»m trong kho¶ng qui ®Þnh cho mçi lo¹i thuèc thö, th«ng th­êng trong kho¶ng 6,0 – 8,0. Do vËy, nªn ®iÒu chØnh pH cña dung dÞch thö cho phï hîp b»ng c¸c dung dÞch acid hydrocloric 0,1M BET, natri hydroxyd 0,1M BET hoÆc mét ®Öm thÝch hîp theo khuyÕn c¸o cña nhµ s¶n xuÊt thuèc thö.

PhÐp thö kh«ng thÝch hîp víi mét sè lo¹i mÉu thö nh­ c¸c lo¹i nhò dÞch, hçn dÞch… Mét sè chÊt cã thÓ cho ph¶n øng d­¬ng tÝnh hoÆc ©m tÝnh gi¶ víi thuèc thö nh­ c¸c chÕ phÈm tõ m¸u, polynucleotid; chÕ phÈm cã chøa kim lo¹i nÆng, chÊt diÖn ho¹t, nång ®é ion cao. Do vËy, cÇn ph¶i kh¶o s¸t, t×m ph­¬ng ph¸p xö lý vµ ®¸nh gi¸ tr­íc khi ¸p dông phÐp thö cho chÕ phÈm.

 

§é pha lo·ng tèi ®a:

§é pha lo·ng tèi ®a (MVD) lµ hÖ sè pha lo·ng lín nhÊt cho phÐp ®Ó thu ®­îc dung dÞch thö cã chøa l­îng néi ®éc tè cã thÓ ph¸t hiÖn ®­îc.

MVD ®­îc tÝnh nh­ sau:

                           Giíi h¹n néi ®éc tè x nång ®é dung dÞch thö

            MVD =

                                                           l

 

Trong ®ã:

Giíi h¹n néi ®éc tè (Endotoxin Limit = EL): giíi h¹n néi ®éc tè th­êng ®­îc quy ®Þnh trong c¸c chuyªn luËn riªng. ChÕ phÈm ®¹t yªu cÇu nÕu l­îng néi ®éc tè cã trong chÕ phÈm thÊp h¬n giíi h¹n qui ®Þnh. Giíi h¹n néi ®éc tè cña c¸c chÕ phÈm ®­îc tÝnh trªn c¬ së liÒu dïng cho ng­êi theo c«ng thøc sau:

                        EL = K/ M

 

Trong ®ã, K lµ ng­ìng néi ®éc tè tÝnh cho 1 kg thÓ träng ng­êi cã thÓ chÞu ®ùng ®­îc mµ kh«ng x¶y ra ph¶n øng ®éc h¹i; Gi¸ trÞ K ®­îc tham kh¶o trong b¶ng 1 d­íi ®©y.

M lµ liÒu tèi ®a cña s¶n phÈm tÝnh cho 1 kg thÓ träng dïng d­íi d¹ng ®¬n liÒu trong thêi gian kho¶ng 1 giê. LiÒu nµy ®­îc hiÓu lµ l­îng thuèc tèi ®a cã thÓ ®­îc dïng trong vßng 1 giê. Víi c¸c lo¹i thuèc tiªm d­íi da, tiªm b¾p hoÆc tiªm tÜnh m¹ch mét lÇn sÏ ®­îc coi nh­ dïng ®¬n liÒu. Víi c¸c dÞch truyÒn tÜnh m¹ch trong thêi gian dµi, tÝnh M theo l­îng thuèc cña liÒu cã thÓ ®­îc truyÒn tèi ®a trong mét giê, dùa trªn tèc ®é truyÒn tiªu chuÈn nÕu kh«ng cã qui ®Þnh riªng nµo cho chÕ phÈm. Gi¸ trÞ ®­îc dïng lµ liÒu tèi ®a theo khuyÕn c¸o cña nhµ s¶n xuÊt, cã thÓ møc liÒu ®ã v­ît qu¸ møc liÒu theo chØ dÉn cña thÇy thuèc.

 

B¶ng 1:

 

Lo¹i s¶n phÈm	K (tÝnh cho 1 kg thÓ träng)
C¸c lo¹i thuèc tiªm trong mµng	0,2
C¸c thuèc phãng x¹ tiªm tÜnh m¹ch	2,5
TÊt c¶ c¸c thuèc tiªm trõ lo¹i tiªm trong mµng hoÆc thuèc phãng x¹	5,0

NÕu mét s¶n phÈm cã thÓ ®­îc dïng theo c¶ 2 ®­êng tiªm trong vá vµ c¸c ®­êng tiªm kh¸c th× giíi h¹n néi ®éc tè cho s¶n phÈm ®­îc tÝnh theo gi¸ trÞ K cña ®­êng tiªm trong vá v× cã yªu cÇu chÆt chÏ h¬n.

Trªn thùc tÕ, c¸c nhµ s¶n xuÊt th­êng qui ®Þnh giíi h¹n néi ®éc tè cho s¶n phÈm thÊp h¬n nhiÒu so víi giíi h¹n tÝnh theo ng­ìng chÞu ®ùng cña ng­êi bÖnh, ®Ó khi dïng liÒu tèi ®a s¶n phÈm vÉn ®¶m b¶o an toµn cho ng­êi bÖnh.

 

Nång ®é cña dung dÞch thö:

TÝnh b»ng mg/ ml nÕu giíi h¹n néi ®éc tè trong chuyªn luËn riªng quy ®Þnh theo khèi l­îng (IU/ mg)

TÝnh b»ng ®¬n vÞ/ ml nÕu giíi h¹n néi ®éc tè trong chuyªn luËn riªng quy ®Þnh theo ®¬n vÞ ho¹t lùc sinh häc (IU/ ®¬n vÞ)

TÝnh b»ng ml/ ml nÕu giíi h¹n néi ®éc tè trong chuyªn luËn riªng quy ®Þnh theo thÓ tÝch (IU/ ml)

 l : lµ ®é nh¹y cña thuèc thö ®­îc ghi trªn nh·n (kü thuËt t¹o gel) hoÆc nång ®é néi ®éc tè thÊp nhÊt ®· dïng ®Ó x©y dùng ®­êng cong chuÈn (ph­¬ng ph¸p ®o ®é ®ôc hoÆc ®o mµu).

 

ph­¬ng ph¸p t¹o gel

Ph­¬ng ph¸p t¹o gel cho phÐp ph¸t hiÖn hoÆc x¸c ®Þnh l­îng néi ®éc tè dùa trªn sù t¹o gel cña thuèc thö lysat víi néi ®éc tè. Nång ®é néi ®éc tè yªu cÇu ®Ó t¹o gel víi thuèc thö lysat trong ®iÒu kiÖn tiªu chuÈn lµ ®é nh¹y ghi trªn nh·n cña thuèc thö. §Ó ®¶m b¶o ®é chÝnh x¸c vµ gi¸ trÞ cña phÐp thö, ph¶i tiÕn hµnh phÐp thö kiÓm tra ®Ó kh¼ng ®Þnh ®é nh¹y ghi trªn nh·n cña thuèc thö lysat vµ kiÓm tra c¸c yÕu tè ¶nh h­ëng theo h­íng dÉn d­íi ®©y.

 

1, ChuÈn bÞ thö

- KiÓm tra ®é nh¹y cña lysat

§é nh¹y cña thuèc thö lysat ghi trªn nh·n lµ nång ®é néi ®éc tè thÊp nhÊt cÇn thiÕt ®Ó t¹o gel víi thuèc thö trong ®iÒu kiÖn x¸c ®Þnh.

PhÐp thö kiÓm tra ®é nh¹y ®­îc thùc hiÖn mçi khi cã l« thuèc thö míi hoÆc khi cã sù thay ®æi ®iÒu kiÖn thÝ nghiÖm cã thÓ ¶nh h­ëng tíi kÕt qu¶ cña phÐp thö.

 

TiÕn hµnh:

ChuÈn bÞ c¸c dung dÞch néi ®éc tè chuÈn víi Ýt nhÊt 4 nång ®é t­¬ng ®­¬ng 2l; l; 1/2l vµ 1/4l b»ng c¸ch pha lo·ng dung dÞch chuÈn gèc víi n­íc BET, mçi nång ®é cÇn 4 èng. Trong ®ã l lµ ®é nh¹y ghi trªn nh·n cña lysat muèn kiÓm tra. Pha thuèc thö lysat víi n­íc BET theo h­íng dÉn trªn nh·n. Trén mét thÓ tÝch thuèc thö víi ®ång l­îng dung dÞch chuÈn (th­êng dïng 0,1 ml) cho mçi èng. §Ó c¸c èng nghiÖm cã chøa hçn hîp ph¶n øng ë 37 ± 1^oC trong 60 ± 2 phót, tr¸nh bÞ rung ®éng m¹nh.

§äc kÕt qu¶ sau mét kho¶ng thêi gian qui ®Þnh. Ph¶n øng d­¬ng tÝnh nÕu gel t¹o thµnh kh«ng bÞ ch¶y ra khi nhÑ nhµng dèc ng­îc èng nghiÖm (180^o). Ph¶n øng ©m tÝnh khi kh«ng t¹o thµnh gel hoÆc gel kh«ng ®ñ ch¾c, rÊt dÔ bÞ r· khi dèc ng­îc èng nghiÖm.

PhÐp thö kh«ng cã gi¸ trÞ nÕu bÊt kú èng nµo cña dung dÞch chuÈn néi ®éc tè cã nång ®é thÊp nhÊt (0,25 l) cho ph¶n øng d­¬ng tÝnh. Khi ®ã, cÇn kiÓm tra kü l¹i c¸c ®iÒu kiÖn thö nghiÖm vµ lÆp l¹i thÝ nghiÖm.

“§iÓm dõng” lµ èng cuèi cïng cã hÖ sè pha lo·ng lín nhÊt trong d·y cho ph¶n øng d­¬ng tÝnh.

§é nh¹y cña thuèc thö ®­îc biÓu thÞ lµ trung b×nh nh©n cña nång ®é ®iÓm dõng (IU/ml), ®­îc tÝnh nh­ sau: tÝnh gi¸ trÞ trung b×nh cña c¸c logarit nång ®é néi ®éc tè t¹i ®iÓm dõng, sau ®ã lÊy ®èi – logarit cña gi¸ trÞ trung b×nh.

Trung b×nh nh©n nång ®é ®iÓm dõng = anti log (Se/ f)

Trong ®ã: (Se = tæng c¸c logarit nång ®é ®iÓm dõng cña mçi d·y ®· thö

        f = sè d·y chuÈn néi ®éc tè ®· thö

 

§é nh¹y ghi trªn nh·n cña thuèc thö ®­îc kh¼ng ®Þnh lµ ®óng nÕu trung b×nh nh©n nång ®é ®iÓm dõng lín h¬n hoÆc b»ng 0,5 l vµ nhá h¬n hoÆc b»ng 2,0 l.

 

KiÓm tra yÕu tè ¶nh h­ëng

PhÐp thö cã ý nghÜa ®Ó kiÓm tra xem trong mÉu thö cã chøa c¸c yÕu tè lµm t¨ng hay øc chÕ ph¶n øng hay kh«ng. Khi cã bÊt kú sù thay ®æi ®iÒu kiÖn nµo ®ã cã thÓ ¶nh h­ëng ®Õn kÕt qu¶  thö nghiÖm, cÇn thùc hiÖn phÐp thö nµy.

ChuÈn bÞ c¸c dung dÞch A, B, C vµ D theo nh­ b¶ng 2. C¸c ®iÒu kiÖn thö nghiÖm nh­ nhiÖt ®é, thêi gian ñ vµ ®¸nh gi¸ kÕt qu¶ t­¬ng tù nh­ trong phÇn KiÓm tra ®é nh¹y cña lysat.

Trung b×nh nh©n nång ®é ®iÓm dõng cña dung dÞch B vµ C ®­îc x¸c ®Þnh theo h­íng dÉn ®· nªu trong phÇn KiÓm tra ®é nh¹y cña lysat.

 

B¶ng 2: KiÓm tra yÕu tè ¶nh h­ëng

 

Dung dÞch	Nång ®é néi ®éc tè ®­îc thªm vµo mçi dung dÞch	Dung m«i	HÖ sè pha lo·ng	Nång ®é néi ®éc tè sau khi pha lo·ng	Sè èng nghiÖm
A	0/ dung dÞch thö	-	-	-	4
B	2l/ dung dÞch thö	dung dÞch mÉu thö	1 2 4 8	2 l 1 l 0,5 l 0,25 l	4 4 4 4
C	2l/ n­íc BET	N­íc BET	1 2 4 8	2 l 1 l 0,5 l         0,25 l	2 2 2 2
D	0/ n­íc BET	-	-	-	2

 

Dung dÞch A (dung dÞch thö): mÉu thö pha ë ®é pha lo·ng ≤ MVD

Dung dÞch B (®èi chøng d­¬ng tÝnh cã mÉu thö): néi ®éc tè pha trong dung dÞch thö ®Ó kiÓm tra yÕu tè ¶nh h­ëng.

Dung dÞch C (kh¼ng ®Þnh ®é nh¹y cña lysat): chuÈn néi ®éc tè pha trong n­íc BET víi nång ®é kh¸c nhau.

Dung dÞch D (®èi chøng ©m tÝnh): n­íc BET

 

PhÐp thö cã gi¸ trÞ khi dung dÞch A vµ D cho ph¶n øng ©m tÝnh vµ kÕt qu¶ dung dÞch C kh¼ng ®Þnh ®é nh¹y cña thuèc thö.

NÕu ®é nh¹y cña lysate tÝnh theo dung dÞch B lín h¬n 0,5 l vµ nhá h¬n 2,0 l th× mÉu thö kh«ng chøa yÕu tè ¶nh h­ëng vµ phÐp kiÓm tra yÕu tè ¶nh h­ëng ®¹t yªu cÇu. NÕu kh«ng tho¶ m·n c¸c yªu cÇu trªn th× mÉu thö cã chøa yÕu tè ¶nh h­ëng tíi phÐp thö.

NÕu mÉu thö kh«ng ®¹t ë ®é pha lo·ng nhá h¬n MVD, lµm l¹i phÐp thö víi ®é pha lo·ng lín h¬n nh­ng kh«ng qu¸ MVD. Sö dông thuèc thö cã ®é nh¹y lín h¬n sÏ cho phÐp mÉu thö ®­îc pha lo·ng nhiÒu h¬n, khi ®ã cã thÓ h¹n chÕ ®­îc yÕu tè ¶nh h­ëng. Ngoµi ra, cã thÓ xö lý ®Ó lo¹i c¸c yÕu tè ¶nh h­ëng b»ng ph­¬ng ph¸p thÝch hîp nh­ läc, trung hoµ, thÈm t¸ch hoÆc ®un nãng. §Ó ®¶m b¶o ph­¬ng ph¸p xö lý ®· chän ch¾c ch¾n lo¹i ®­îc yÕu tè ¶nh h­ëng mµ kh«ng lµm mÊt néi ®éc tè, cÇn thùc hiÖn phÐp thö KiÓm tra yÕu tè ¶nh h­ëng víi dung dÞch thö sau khi xö lý vµ cho thªm chuÈn néi ®éc tè. NÕu ph­¬ng ph¸p cã hiÖu qu¶, cÇn ghi vµo tiªu chuÈn.

 

2, PhÐp thö giíi h¹n

Dùa trªn sù t¹o gel cña thuèc thö lysat víi néi ®éc tè, ph­¬ng ph¸p nµy kiÓm tra xem l­îng néi ®éc tè cã trong mÉu thö cã lín h¬n giíi h¹n qui ®Þnh hay kh«ng.

TiÕn hµnh: ChuÈn bÞ dung dÞch A, B, C vµ D theo b¶ng 3, mçi dung dÞch 2 èng. C¸c ®iÒu kiÖn thö nghiÖm nh­ nhiÖt ®é, thêi gian ñ vµ ®¸nh gi¸ kÕt qu¶ t­¬ng tù nh­ trong phÇn KiÓm tra ®é nh¹y cña lysat.

 

B¶ng 3:

Dung dÞch	Nång ®é néi ®éc tè thªm vµo cho mçi dung dÞch	Sè èng nghiÖm
A	0/ dung dÞch thö	2
B	2 l/ dung dÞch thö	2
C	2 l/ n­íc BET	2
D	0/ n­íc BET	2

 

Trong ®ã:

-   Dung dÞch A (dung dÞch thö): mÉu thö pha ë ®é pha lo·ng ≤ MVD

-   Dung dÞch B (®èi chøng d­¬ng tÝnh cã mÉu thö): néi ®éc tè pha trong dung dÞch thö.

-   Dung dÞch C (®èi chøng d­¬ng tÝnh): chuÈn néi ®éc tè pha trong n­íc BET

-   Dung dÞch D (®èi chøng ©m tÝnh): n­íc BET

 

§¸nh gi¸ kÕt qu¶:

PhÐp thö cã gi¸ trÞ nÕu c¶ 2 èng cña dung dÞch B vµ C ®Òu cho kÕt qu¶ d­¬ng tÝnh vµ dung dÞch D ©m tÝnh.

MÉu thö ®¹t yªu cÇu nÕu kÕt qu¶ ©m tÝnh ë c¶ hai èng nghiÖm cña dung dÞch A.

MÉu thö kh«ng ®¹t yªu cÇu nÕu kÕt qu¶ d­¬ng tÝnh trªn c¶ hai èng nghiÖm cña dung dÞch A khi ®é pha lo·ng b»ng MVD.

NÕu hai èng cña dung dÞch A cho kÕt qu¶ kh¸c nhau, mét èng d­¬ng tÝnh vµ mét èng ©m tÝnh th× lµm l¹i phÐp thö. MÉu thö ®¹t yªu cÇu nÕu ë lÇn thö thø hai c¶ hai èng ®Òu cho kÕt qu¶ ©m tÝnh.

 

3, PhÐp thö b¸n ®Þnh l­îng

PhÐp thö nµy x¸c ®Þnh l­îng néi ®éc tè cã trong dung dÞch mÉu thö b»ng c¸ch thùc hiÖn ph¶n øng tiÕn dÇn tíi ®iÓm dõng trong qu¸ tr×nh t¹o gel.

TiÕn hµnh: ChuÈn bÞ dung dÞch A, B, C vµ D theo b¶ng 4, mçi dung dÞch 2 èng nghiªm.

Dung dÞch thö dïng cho dung dÞch A vµ B ph¶i kh«ng cã chøa yÕu tè ¶nh h­ëng. C¸c ®iÒu kiÖn thö nghiÖm nh­ nhiÖt ®é, thêi gian ñ vµ ®¸nh gi¸ kÕt qu¶ t­¬ng tù nh­ trong phÇn KiÓm tra ®é nh¹y cña lysat.

B¶ng 4:

 

Dung dÞch	Nång ®é néi ®éc tè ®­îc thªm vµo mçi dung dÞch	Dung m«i	HÖ sè pha lo·ng	Nång ®é néi ®éc tè sau khi pha lo·ng	Sè èng nghiÖm
A	0/ dung dÞch mÉu thö	-	1 2 4 8	-	2 2 2 2
B	2l/ dung dÞch mÉu thö	Dung dÞch mÉu thö	1	2 l	2
C	2l/ n­íc BET	N­íc BET	1 2 4 8	2 l 1 l 0,5 l 0,25 l	2 2 2 2
D	0/ n­íc BET	-	-	-	2

-   Dung dÞch A (dung dÞch thö): dung dÞch thö cã ®é pha lo·ng ≤ MVD, kh«ng cã yÕu tè ¶nh h­ëng. Pha mÉu thö víi n­íc BET theo c¸c hÖ sè pha lo·ng 1/2, 1/4, 1/8 ... Cã thÓ pha lo·ng tiÕp ®Ó cã kÕt qu¶ phï hîp nh­ng hÖ sè pha lo·ng dung dÞch thö cuèi cïng ph¶i kh«ng qu¸ MVD.

-   Dung dÞch B (®èi chøng d­¬ng tÝnh cã mÉu thö): néi ®éc tè pha trong dung dÞch A, ®Ó kiÓm tra yÕu tè øc chÕ sù t¹o gel.

-   Dung dÞch C (®èi chøng d­¬ng tÝnh): 2 d·y chuÈn néi ®éc tè pha trong n­íc BET

-   Dung dÞch D (®èi chøng ©m tÝnh): dïng n­íc BET

 

TÝnh to¸n vµ ®¸nh gi¸ kÕt qu¶:

PhÐp thö cã gi¸ trÞ khi tho¶ m·n 3 ®iÒu kiÖn sau:

a, C¶ 2 èng cña dung dÞch D ®Òu ©m tÝnh (®èi chøng ©m tÝnh)

b, C¶ 2 èng cña dung dÞch B ®Òu d­¬ng tÝnh (®èi chøng d­¬ng tÝnh cã mÉu thö).

c, Trung b×nh nh©n nång ®é ®iÓm dõng cña dung dÞch C n»m trong kho¶ng 0,5l - 2 l

 

§iÓm dõng ®­îc x¸c ®Þnh lµ èng nghiÖm cã hÖ sè pha lo·ng cao nhÊt trong d·y cña dung dÞch A cho ph¶n øng d­¬ng tÝnh, vµ nång ®é néi ®éc tè ë ®iÓm dõng cña dung dÞch A lµ tÝch sè cña ®é pha lo·ng t¹i ®iÓm ®ã nh©n víi hÖ sè l.

Nång ®é néi ®éc tè trong dung dÞch mÉu cÇn kiÓm tra ®­îc x¸c ®Þnh lµ trung b×nh nh©n nång ®é ®iÓm dõng cña c¸c d·y thö, tÝnh trung b×nh nång ®é néi ®éc tè cña 2 d·y (t­¬ng tù nh­ phÇn KiÓm tra ®é nh¹y cña lysat)

 

NÕu kh«ng cã nång ®é nµo cña dung dÞch A cho ph¶n øng d­¬ng tÝnh, th× nång ®é néi ®éc tè cña dung dÞch A nhá h¬n l x hÖ sè pha lo·ng thÊp nhÊt cña dung dÞch A.

NÕu tÊt c¶ c¸c ®é pha lo·ng ®Òu cho ph¶n øng d­¬ng tÝnh, nång ®é néi ®éc tè cña dung dÞch A lµ b»ng hoÆc lín h¬n tÝch cña hÖ sè pha lo·ng lín nhÊt cña dung dÞch A nh©n víi l.

Cã thÓ pha lo·ng tiÕp ®Ó t×m ®­îc ®iÓm dõng. TÝnh nång ®é néi ®éc tè cña mÉu thö (EU/ ml, EU/ mg hoÆc mEq hoÆc EU/ ®¬n vÞ), dùa trªn nång ®é néi ®éc tè trung b×nh cña dung dÞch A. MÉu thö ®¹t yªu cÇu phÐp thö nµy nÕu nång ®é néi ®éc tè cã trong mÉu thö thÊp h¬n giíi h¹n néi ®éc tè qui ®Þnh trong chuyªn luËn riªng.

 

 

Ph­¬ng ph¸p ®o quang

 

1. Ph­¬ng ph¸p ®o ®é ®ôc

 Ph­¬ng ph¸p ®o ®é ®ôc x¸c ®Þnh l­îng néi ®éc tè cã trong dung dÞch mÉu thö dùa trªn ®o møc ®é thay ®æi ®é ®ôc trong qu¸ tr×nh t¹o gel cña thuèc thö lysat. HiÖn nay cã 2 kü thuËt  ®­îc ¸p dông: ®o ®é ®ôc t¹i ®iÓm dõng hoÆc ®o ®é ®ôc ®éng häc.

§o ®é ®ôc t¹i ®iÓm dõng dùa trªn sù t­¬ng quan gi÷a nång ®é néi ®éc tè vµ ®é ®ôc cña hçn hîp ph¶n øng ë thêi ®iÓm x¸c ®Þnh vµo cuèi cña giai ®o¹n ñ.

§o ®é ®ôc ®éng häc dùa trªn sù t­¬ng quan gi÷a nång ®é néi ®éc tè vµ thêi gian cÇn thiÕt ®Ó ®¹t tíi ®é ®ôc ®Þnh tr­íc cña hçn hîp ph¶n øng hoÆc tèc ®é t¨ng ®é ®ôc cña hçn hîp.

PhÐp thö th­êng thùc hiÖn ë 37 ± 1^oC, ®é ®ôc biÓu thÞ b»ng ®é hÊp thô hay ®é truyÒn qua.

 

2. Ph­¬ng ph¸p ®o mµu

Ph­¬ng ph¸p ®o mµu x¸c ®Þnh nång ®é néi ®éc tè cña c¸c dung dÞch mÉu thö dùa trªn ®o chÊt mµu ®­îc gi¶i phãng ra tõ mét c¬ chÊt mang mµu do ph¶n øng cña néi ®éc tè víi thuèc thö lysat.

Cã 2 kü thuËt ®o: ®o mµu t¹i ®iÓm dõng hoÆc ®o mµu ®éng häc.

§o mµu t¹i ®iÓm dõng dùa trªn t­¬ng quan gi÷a nång ®é néi ®éc tè vµ ®Ëm ®é chÊt mµu t¹o thµnh cña hçn hîp ph¶n øng ë ®iÓm cuèi cña giai ®o¹n ñ.

§o mµu ®éng häc dùa trªn mèi t­¬ng quan ®Þnh l­îng gi÷a nång ®é néi ®éc tè vµ thêi gian cÇn thiÕt ®Ó hçn hîp ph¶n øng ®¹t tíi ®é hÊp thô (hoÆc ®é truyÒn qua) ®Þnh tr­íc hoÆc tèc ®é t¨ng mµu cña hçn hîp.

PhÐp thö th­êng thùc hiÖn ë 37 ± 1^oC.

 

3. ChuÈn bÞ:

§Ó ®¶m b¶o ®é ®óng vµ gi¸ trÞ cña ph­¬ng ph¸p ®o mµu hoÆc ®o ®é ®ôc, ph¶i tiÕn hµnh phÐp thö KiÓm tra ®­êng chuÈn vµ KiÓm tra yÕu tè ¶nh h­ëng nh­ sau:

- KiÓm tra ®­êng chuÈn: PhÐp thö ®­îc thùc hiÖn víi mçi l« thuèc thö lysat míi. Dïng dung dÞch néi ®éc tè chuÈn, pha Ýt nhÊt 3 nång ®é néi ®éc tè ®Ó t¹o ®­îc ®­êng chuÈn trong kho¶ng nång ®é néi ®éc tè ghi  trong h­íng dÉn cña thuèc thö lysat ®ang sö dông. Víi mçi nång ®é, ph¶i dïng Ýt nhÊt 3 èng tuú theo ®iÒu kiÖn qui ®Þnh cho thuèc thö lysat ®ang dïng (vÒ tû lÖ thÓ tÝch, thêi gian ñ, nhiÖt ®é, pH…). *

Gi¸ trÞ tuyÖt ®èi cña hÖ sè t­¬ng quan [r], ph¶i lín h¬n hoÆc b»ng 0,980 cho kho¶ng nång ®é néi ®éc tè ®· dïng.

NÕu phÐp thö kh«ng cã gi¸ trÞ, kiÓm tra c¸c ®iÒu kiÖn thö nghiÖm vµ tiÕn hµnh l¹i nh­ trªn.

PhÐp thö KiÓm tra ®­êng chuÈn ph¶i ®­îc thùc hiÖn mçi khi cã thay ®æi mét ®iÒu kiÖn nµo ®ã cã thÓ ¶nh h­ëng ®Õn kÕt qu¶ thö nghiÖm.

 

- KiÓm tra yÕu tè ¶nh h­ëng: Chän nång ®é néi ®éc tè vµo kho¶ng gi÷a cña ®­êng chuÈn.

ChuÈn bÞ dung dÞch A, B, C vµ D theo b¶ng 5. TiÕn hµnh phÐp thö víi c¸c dung dÞch nµy sau khi ®· chuÈn ho¸ c¸c ®iÒu kiÖn theo qui ®Þnh cña lo¹i thuèc thö lysat sö dông (vÒ thÓ tÝch, tû lÖ thÓ tÝch dung dÞch thö vµ thuèc thö lysat, thêi gian ñ)

PhÐp thö KiÓm tra yÕu tè ¶nh h­ëng ph¶i ®­îc thùc hiÖn mçi khi cã sù thay ®æi cã thÓ ¶nh h­ëng tíi kÕt qu¶ thö nghiÖm.

B¶ng 5:

 

Dung dÞch	Nång ®é néi ®éc tè thªm vµo mçi dung dÞch	Dung dÞch ®­îc thªm néi ®éc tè	Sè èng nghiÖm hoÆc lç ph¶n øng
A	0	Dung dÞch mÉu	Kh«ng Ýt h¬n 2
B	Nång ®é ë kho¶ng gi÷a cña ®­êng cong chuÈn	Dung dÞch mÉu	Kh«ng Ýt h¬n 2
C	Ýt nhÊt 3 nång ®é	N­íc BET	Mçi nång ®é kh«ng Ýt h¬n 2
D	0	N­íc BET	Kh«ng Ýt h¬n 2

 

-   Dung dÞch A (dung dÞch thö): Dung dÞch mÉu pha lo·ng kh«ng qu¸ MVD

-   Dung dÞch B: Thªm dung dÞch chuÈn vµo dung dÞch mÉu thö ®Ó cã nång ®é néi ®éc tè vµo kho¶ng ®o¹n gi÷a cña ®­êng cong chuÈn

-   Dung dÞch C (®èi chøng d­¬ng tÝnh): dung dÞch chuÈn néi ®éc tè cã nång ®é dïng trong thÈm ®Þnh ph­¬ng ph¸p nh­ m« t¶ trong phÇn KiÓm tra ®­êng chuÈn.

-   Dung dÞch D (®èi chøng ©m tÝnh): dïng n­íc BET

 

PhÐp thö chØ cã gi¸ trÞ khi hÖ sè t­¬ng quan cña ®­êng chuÈn thu ®­îc tõ dung dÞch C lín h¬n hoÆc b»ng 0,980

Dung dÞch D ph¶i cho kÕt qu¶ kh«ng v­ît qu¸ giíi h¹n gi¸ trÞ tr¾ng theo qui ®Þnh cña thuèc thö lysat ®· dïng, hoÆc thÊp h¬n giíi h¹n néi ®éc tè ph¸t hiÖn cña lysat ®· dïng.

 

Kh¶ n¨ng t×m l¹i ®­îc l­îng néi ®éc tè chuÈn thªm vµo dung dÞch B b»ng hiÖu sè nång ®é ®· t×m thÊy trong dung dÞch B trõ ®i nång ®é néi ®éc tè t×m ®­îc trong dung dÞch A.

NÕu kh¶ n¨ng t×m l¹i l­îng néi ®éc tè thªm vµo n»m trong kho¶ng 50% - 200%, dung dÞch mÉu cÇn kiÓm tra ®­îc coi lµ kh«ng cã yÕu tè ¶nh h­ëng.

NÕu nång ®é t×m l¹i ®­îc n»m ngoµi kho¶ng qui ®Þnh, dung dÞch mÉu cÇn kiÓm tra cã chøa yÕu tè ¶nh h­ëng. Khi ®ã, cÇn xö lý ®Ó lo¹i yÕu tè ¶nh h­ëng b»ng c¸c ph­¬ng ph¸p thÝch hîp (nh­ ®· nªu trong ph­¬ng ph¸p t¹o gel). Sau ®ã, ph¶i thùc hiÖn ®¸nh gi¸ l¹i xem ph­¬ng ph¸p xö lý cã lo¹i ®­îc yÕu tè ¶nh h­ëng kh«ng.

 

4, X¸c ®Þnh l­îng néi ®éc tè trong mÉu thö

- TiÕn hµnh: ChuÈn bÞ dung dÞch A, B, C vµ D theo nh­ b¶ng 5, vµ theo qui tr×nh nh­ ®· m« t¶ trong phÇn KiÓm tra yÕu tè ¶nh h­ëng.

- TÝnh nång ®é néi ®éc tè

TÝnh nång ®é néi ®éc tè trong mçi èng cña dung dÞch A theo ®­êng chuÈn thu ®­îc tõ dung dÞch C. PhÐp thö kh«ng cã gi¸ trÞ trõ khi tho¶ m·n c¸c yªu cÇu sau:

1. Gi¸ trÞ tuyÖt ®èi cña hÖ sè t­¬ng quan cña ®­êng chuÈn theo dung dÞch C lín h¬n hoÆc b»ng 0,980

2. L­îng néi ®éc tè t×m l¹i ®­îc, tøc lµ hiÖu sè nång ®é néi ®éc tè t×m l¹i ®­îc trong dung dÞch B trõ ®i nång ®é néi ®éc tè trong dung dÞch A, ph¶i n»m trong kho¶ng 50% - 200%.

KÕt qu¶ cña dung dÞch D kh«ng v­ît qu¸ giíi h¹n gi¸ trÞ tr¾ng cña thuèc thö lysat ®· dïng, hoÆc ph¶i thÊp h¬n giíi h¹n néi ®éc tè ph¸t hiÖn cña lysat ®· dïng.

§¸nh gi¸ kÕt qu¶:

MÉu thö ®¹t phÐp thö néi ®éc tè vi khuÈn nÕu nång ®é néi ®éc tè cña mÉu thö tÝnh tõ nång ®é néi ®éc tè trung b×nh cña c¸c èng dung dÞch A thÊp h¬n giíi h¹n néi ®éc tè qui ®Þnh trong chuyªn luËn riªng.

 

* NÕu tû sè gi¸ trÞ logarit ®¸p øng gi÷a nång ®é cao nhÊt so víi nång ®é thÊp nhÊt trong kho¶ng kh¶o s¸t lín h¬n 2, th× nªn thªm mét sè nång ®é ®Ó thu ®­îc ®­êng chuÈn cã kho¶ng c¸ch gi÷a c¸c gi¸ trÞ log phï hîp.